华中农大近期科学研究进展

揭示丽莎病毒属M蛋白劫持自噬小体、诱发神经损伤以及与宿主因子TRIM72互作的新机制

近期，华中农业大学动物科学技术学院、动物医学院赵凌教授课题组在丽莎病毒属的M蛋白劫持自噬小体促进自身出芽、诱发神经骨架损伤，以及与宿主因子TRIM72互作等方面取得了一系列的研究进展。

狂犬病（Rabies）是一种由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）感染宿主中枢神经系统的重要人兽共患病，一旦发病死亡率接近100%，每年造成全球约59000人死亡。RABV是丽莎病毒属（Lyssavirus）的成员之一，该病毒属还有澳大利亚蝙蝠丽莎病毒（ABLV）、Duvenhage丽莎病毒（DUVV）和欧洲蝙蝠丽莎病毒（EBLV）等其他成员。丽莎病毒为单股负链RNA病毒，可编码5个结构蛋白，包括 Nucleoprotein（N）, Phosphoprotein（P）, Matrix protein（M）, Glycoprotein（G）和Large RNA polymerase protein（L），其中M蛋白在病毒的组装和出芽过程中发挥重要作用。

2024年4月2日，课题组在国际学术期刊Autophagy发表题为“The matrix protein of lyssavirus hijacks autophagosome for efficient egress by recruiting NEDD4 through its PPxY motif”的研究论文。

该研究发现了丽莎病毒在感染神经系统后能通过M蛋白的PPxY基序与E3泛素连接酶Nedd4相互作用，从而诱导自噬小体的生成，并进一步利用自噬小体来促进病毒的出芽。本研究为丽莎病毒致病机制的解析奠定基础。华中农业大学动物科学技术学院、动物医学院博士研究生袁悦铭、房安为论文共同第一作者，赵凌教授、周明副教授为该论文的共同通讯作者。

2024年2月13日，课题组在微生物学领域学术期刊mBio杂志发表题为“Lyssavirus M protein degrades neuronal microtubules by reprogramming mitochondrial metabolism”的研究论文。该研究揭示了丽莎病毒在感染神经系统后能通过M蛋白与Slc25a4相互作用来下调ATP的产生水平，从而下调胞浆中的NAD+水平，使胞浆中的Ca2+水平大幅提升，最终导致细胞的微管蛋白降解，造成神经损伤。本研究为揭示丽莎病毒造成神经损伤的机制提供新的线索。华中农业大学动物科学技术学院、动物医学院博士研究生袁悦铭、房安为论文共同第一作者，赵凌教授、周明副教授为该论文的共同通讯作者。

2024年2月26日，课题组在病原学领域学术期刊PLoS Pathogens杂志发表题为“TRIM72 restricts lyssavirus infection by inducing K48-linked ubiquitination and proteasome degradation of the matrix protein”的研究论文。该研究揭示了宿主限制性因子TRIM72能与丽莎病毒M蛋白发生直接相互作用，并通过促进M蛋白的泛素化促进其降解，从而抑制丽莎病毒组装/出芽的分子机制。该研究为进一步阐明丽莎病毒与宿主间的相互作用提供了新思路。华中农业大学动物科学技术学院、动物医学院博士后隋保坤和博士研究生郑嘉欣为该论文的共同第一作者，赵凌教授、周明副教授为该论文的共同通讯作者。

原文链接1：

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/15548627.2024.2338575

原文链接2：

https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.02880-23

原文链接3：

https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1011718

揭示转录因子OsWRKY37调控铜吸收运输影响水稻开花结实的分子机制

近期，华中农业大学植物营养生物学团队在Plant Physiology杂志上发表了题为“OsWRKY37 acts as a positive regulator for flowering time and grain fertility in rice under copper deficient condition”的研究论文，揭示了缺铜条件下转录因子OsWRKY37调控铜吸收运输影响水稻开花结实的分子机制。

铜是植物生长发育所必需的微量营养元素，也是对水稻花器官发育和产量形成影响最大的微量元素；缺铜易导致水稻开花期推迟、花药形成受阻、花粉活性下降、结实率降低、无效分蘖增加，从而严重影响水稻籽粒产量。近年来，我国高强度、集约化土地利用方式及作物复种比例的增加，加剧了土壤养分的携出量，降低了土壤肥力水平；同时，由于耕作过程中忽视微量元素肥料施用，引起土壤养分比例失衡，极易导致耕地铜缺乏，从而影响水稻正常的生殖生长及产量形成。随着科学研究的不断探索以及对水稻基因功能的逐步解析，参与水稻铜吸收和运输过程的重要基因特别是转运基因不断被克隆和鉴定，在水稻中逐渐形成了一个清晰的铜运输路径，然而该过程的上游调控因子及其具体的调控网络尚不清楚。

课题组前期对不同铜水平处理下的水稻根系进行转录组分析，获得一个受缺铜诱导表达功能未知的WRKY转录因子OsWRKY37。荧光定量PCR和ProOsWRKY37:GUS转基因植株分析结果显示，OsWRKY37主要在根、叶片、叶枕、节的维管组织、新生小穗以及花药中表达。缺铜条件下，超量表达OsWRKY37促进水稻根系对铜的吸收以及铜从根向地上部的转运；而敲除突变OsWRKY37抑制铜从根向地上部的转运以及向小穗的分配，显著降低雄蕊中的铜含量，影响花粉发育；敲除突变体表现为开花期推迟、育性降低、籽粒产量下降（图1）。酵母单杂交、烟草瞬时表达、EMSA和ChIP-qPCR等试验证明，OsWRKY37可与铜转运基因OsCOPT6及OsYSL16启动子中的W-box相互结合，并上调其表达水平（图2）。总而言之，缺铜诱导OsWRKY37表达，OsWRKY37可与OsCOPT6和OsYSL16的启动子相互结合，正向调控其表达水平，促进水稻根系对铜的吸收以及铜从根向地上部和小穗中转运，有利于花器官正常发育及籽粒产量形成。

图1 缺铜条件下敲除突变OsWRKY37影响开花期及籽粒产量

图2 OsWRKY37可与OsCOPT6和OsYSL16启动子相互结合

图3 OsWRKY37调控OsCOPT6和OsYSL16促进铜吸收运输的作用模式图

华中农业大学资源与环境已毕业博士姬晨晨为第一作者，蔡红梅副教授为通讯作者，已毕业博士丁静丽和已毕业硕士李海星、郁露参与了该研究，徐芳森教授、石磊教授、姜存仓教授、王创教授、丁广大教授和汪社亮副教授对该研究的试验设计和数据分析提供了建议。

原文链接：

https://academic.oup.com/plphys/advance-article/doi/10.1093/plphys/kiae187/7642445?searchresult=1&login=true

在泛基因组变异分型算法研究领域取得新进展

近日，华中农业大学果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室、湖北洪山实验室焦文标课题组在Genome Biology上发表了题为“A comprehensive benchmark of graph-based genetic variant genotyping algorithms on plant genomes for creating an accurate ensemble pipeline”的研究论文。

研究结果表明，基于图形泛基因组的遗传变异分型算法虽然可以提高变异分型的准确性，但由于植物基因组的复杂性，其在植物基因组变异分型上仍存在巨大挑战。该研究还开发了一套适用于植物的图形基因组变异分型软件EVG。该项泛基因组研究将为农艺作物种质资源基因型鉴定、作物精准分子育种等领域提供准确高效的算法工具。

高通量DNA测序技术的飞速发展，使得科研工作者能快速、大规模地构建植物基因组的遗传变异图谱，也促进了泛基因组、全基因组关联分析等研究领域的快速发展。这些研究通常需要对大量个体基因组的重测序数据进行变异分型。传统分型算法依赖短序列比对，即将个体基因组的短片段测序数据比对到单个线性参考基因组。然而，由于单个参考基因组的偏好性，部分来自基因组高度差异区域的测序读段往往不能正确比对。此外，传统方法难以利用短片段数据，对结构变异正确地进行分型。

有研究表明，基于图形泛基因组的分型算法，能整合多个基因组的序列信息，降低比对偏好性，提高比对准确度，进而提升变异分型的能力。目前，众多研究者已经开发了多种基于图形泛基因组理论的变异分型算法。这些算法主要基于两类策略，即利用读段比对或Kmer谱比较进行变异分型，包括vg、GraphTyper、BayesTyper、PanGenie等。然而，这些算法主要基于人类基因组开发，并未考虑到植物基因组自身的特点（如：重复序列高、杂合度高、存在多倍体等）。

图1 图形基因组算法在不同植物基因组上的整体性能

为了探究这些算法在植物基因组变异分型中的应用效果，研究者通过准备拟南芥、水稻、大豆、玉米、油菜（异源四倍体）和杏（杂合二倍体）的模拟数据和真实数据，系统性地测试了目前常用的8款图形基因组变异分型软件在不同基因组复杂度、测序读长与深度、基因组杂合度、变异断点误差等条件下的分型效果。结果表明，随着基因组大小和重复序列的增加，算法的分型召回率会出现不同程度的降低（图1）；在读段长度为150bp、测序深度在10X以上时，多数软件能有较好的变异分型效果。另外，随着群体变异数量的增加，基因组图的索引将变得异常复杂，同时会消耗大量的计算资源。研究者还测试了不同杂合度的基因组（0%-2.35%），结果表明，基因组杂合度同样会影响到变异的分型。此外，部分软件在结构变异位点出现断点错误、较小变异（如SNP、indel）或重复序列时，对结构变异的分型能力会出现较明显的下降。

尽管现有的图形基因组分型算法并非在所有的测试条件下都表现出出色的基因分型性能，但它们在分型能力上仍有很高的互补性。为了整合不同算法的优势，研究者开发了一款适用于植物基因组的集成式分型软件EVG（Ensemble Variant Genotyper）。该软件可以根据测序深度、读长、基因组大小等信息，自动选择用于下游分型的图形基因组分型算法，并且对输入输出文件格式进行适当转换。对于每个变异位点的最终分型结果，EVG会根据变异的大小和位置进行聚类，并基于多个算法的分型结果来确定最终的基因型（图2）。最后，研究者使用上述同样的模拟数据和真实数据，对EVG的分型能力进行了全面测试。结果表明，在各项测试条件下，EVG的分型效果更为稳定，能同时保持较高的准确率和召回率，并且只需要10×的测序数据即可获得较好的分型效果。

图2 EVG软件算法流程

综上所述，该研究揭示了现有图形基因组算法应用于植物基因组变异分型的重大挑战，包括资源消耗较高、重复序列相关变异分型较差和分型性能不稳定等。并且，研究者开发了适用于植物基因组的图形基因组集成式分型算法EVG。此算法有望用于构建基于低覆盖度重测序数据的作物大规模群体水平的遗传变异（包括结构变异等）图谱；推动植物基因泛基因组等领域的深入研究。

华中农业大学果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室、湖北洪山实验室、信息学院博士研究生杜泽臻为文章第一作者，焦文标教授为通讯作者。硕士研究生贺家宝也参与了该研究工作。

揭示miR159a-DUO1模块调控柑橘花粉育性的机制

近日，国际学术期刊JIPB在线发表了华中农业大学果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室伊华林/吴巨勋课题组题为"The miR159a-DUO1 module regulates pollen development by modulating auxin biosynthesis and starch metabolism in citrus"的研究论文，揭示了miR159a-DUO1模块整合生长素合成和淀粉代谢途径调控柑橘花粉发育的分子机制。

果实无核化是柑橘育种的重要目标，是鲜食柑橘品种的核心需求之一，但是目前对于该性状形成的分子机制的认识仍较浅显。柑橘童期长且杂合度高，基于现有的育种手段选育无核柑橘新品种周期长，利用分子设计育种进行定向改良成为提高无核育种效率的可行且高效的育种手段。因此挖掘柑橘无核调控关键基因资源，深入研究柑橘无核性状形成的分子调控机制，对加速柑橘分子育种具有重要意义。

在前期研究中，该课题组基于脐橙小RNA组和降解组测序鉴定出一个差异表达的csi-miR159a及其4个靶基因CsDUO1、CsGAMYB、CsNOZZLE (SPOROCYTELESS)和CsPGIP1 (Wu et al., 2016)。该研究通过烟草瞬时表达实验和5’RACE验证DUO1、GAMYB、NZZ是柑橘中csi-miR159a真正的靶基因。在山金柑中超表达csi-miR159a导致小的无核果实产生和花粉发育缺陷。山金柑DUO1敲除株系花粉败育和无核表型与csi-miR159a超表达株系一致。通过异花授粉实验，证明DUO1是csi-miR159a调控柑橘雄性不育的关键靶基因。透射电镜和花粉DAPI染色进一步表明csi-miR159a超表达株系和DUO1敲除系花粉第一次有丝分裂受阻和花粉中淀粉代谢异常。

为了解析其中的分子机制，通过转录组测序和DAP-Seq测序关联分析，鉴定到DUO1下游关键靶基因YUC2/YUC6和SS4/STP8。随后，通过酵母单杂交、LUC、EMSA等实验，验证DUO1可与YUC2/YUC6和SS4/STP8互作。经研究发现，csi-miR159a通过靶向DUO1正调控生长素合成基因YUC2/YUC6的表达，进而参与生长素合成及信号转导的调控，从而参与调控柑橘花粉第一次有丝分裂；而csi-miR159a通过靶向DUO1直接调控淀粉合成基因SS4和糖转运基因STP8的表达，进而调控柑橘花粉中淀粉代谢（图1）。该研究揭示了miR159a-DUO1模块通过调节生长素的生物合成和淀粉代谢来调控柑橘花粉发育的分子机制，为柑橘无核分子育种提供了理论依据及优良基因资源。

图1 miR159a-DUO1模块调控柑橘花粉发育的模示图

华中农业大学果树系已毕业博士徐彦辉为论文第一作者，华中农业大学果树系吴巨勋副教授为该论文通讯作者。华中农业大学果树系伊华林教授在实验设计、论文撰写方面提供了指导和宝贵的意见，中南林业科技大学袁德义教授在论文撰写方面提供了指导。博士研究生张力、尹民强和蔡珍梅以及硕士研究生田文秀参与了研究。

论文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jipb.13656

由于篇幅所限，本文分享的内容仅为近期华中农业大学科学研究成果的一部分。更多科研动态，欢迎点击文末“阅读原文”，浏览华中农业大学南湖新闻网科学研究专题进一步了解。